近年來，食源性致病菌生物菌膜已成為食品安全領(lǐng) 域中的研究熱點(diǎn)。生物菌膜是細(xì)菌在生長過程中為適 應(yīng)生存環(huán)境而黏附、生長于組織表面，在菌體-菌體和菌 體-接觸面的相互作用下，通過菌體增殖、分泌胞外基質(zhì) 而形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的細(xì)菌聚集體。形成菌膜 后，細(xì)菌菌體對外界環(huán)境的抵抗力會大大增強(qiáng)，對工業(yè) 清洗劑和消毒劑具有更強(qiáng)耐受性，不易清除，殘留的生 物菌膜可在環(huán)境適宜時(shí)脫落出細(xì)菌菌體，成為潛在污染 源，進(jìn)一步造成交叉污染，引發(fā)嚴(yán)重的食品安全問題。 大腸桿菌O157:H7是全球范圍內(nèi)備受關(guān)注的食源性致病 菌，每年都會爆發(fā)多起因大腸桿菌O157:H7污染而引發(fā)的 食物中毒事件。有研究表明，大腸桿菌O157:H7在固體表 面（如加工器械表面、畜禽胴體表面等）產(chǎn)生黏附的特 性是其造成交叉污染的主要原因。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用大腸桿菌O157:H7共1 4 株，包括菌株 CICC21530（購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心） 菌株ATCC43895（購自美國菌種保藏中心）、菌株 NCTC12900（購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）， 其余11 株為南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室 分離自牛肉和牛糞。胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya agar，TSA）培 養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）、 胰蛋白胨大豆瓊脂酵母提取物（tryptone soya agar yeast extract，TSAYE）培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限公司； LIVE/DEAD® BacLight Bacterial Viability Kits（L7012） 美國Molecular Probes公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、 氯化鈉、結(jié)晶紫、乳酸、戊二醛、鋨酸、乙醇 南京化 學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

M2多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公 司；SZX超凈工作臺 上海浦東躍欣儀器廠；LDZX30FBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠； SG403A Sterile GDRD生物安全柜 美國Baker公司； 拍打式均質(zhì)器 青島眾瑞智能儀器有限公司；生化培 養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；QL-200微型 漩渦混合儀 海門其林貝爾儀器有限公司；2-16KL高 速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；DHP-9052型電熱恒 溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；LSM 710 CLSM 德國Carl Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 菌液制備

凍藏的14 株大腸桿菌O157:H7經(jīng)TSA平板劃線，于 37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種至3 mL TSB中，37 ℃ 搖床培養(yǎng)18 h，再吸取1 mL菌液轉(zhuǎn)接至100 mL TSB 中，37 ℃搖床培養(yǎng)18 h，使菌液濃度達(dá)到108 CFU/mL 左右。取1 mL培養(yǎng)好的菌液離心（6 000×g、5 min、 4 ℃），棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）洗滌 2 次，重懸后備用。

1.3.2 大腸桿菌O157:H7黏附性能比較

采用微孔板結(jié)合結(jié)晶紫染色法。取500?μL 備用菌液，接種至一定體積TSB中（菌體濃度約為 2～3（lg（CFU/mL））。吸取180?μL置于96 孔細(xì)胞培養(yǎng) 板中，封口膜包被，于25 ℃培養(yǎng)72 h，以不接種細(xì)菌的 TSB作為空白對照。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去微孔中的細(xì)菌培 養(yǎng)液，無菌蒸餾水洗滌3 次，室溫下干燥45 min后，每孔 加入200?μL?0.25?g/100 mL結(jié)晶紫染液染色30 min，棄去 染液并用無菌蒸餾水洗滌3 次，200 µL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇 溶液洗脫30 min，最后將微孔板置于酶標(biāo)儀中在570 nm 波長處測定其OD值。每個菌株重復(fù)6 次。

1.3.3 微孔法分析大腸桿菌O157:H7生物菌膜的形成曲線

根據(jù)1.3.2節(jié)結(jié)果，選取生物菌膜形成能力不同的幾 株大腸桿菌O157:H7，按1.3.2節(jié)方法進(jìn)行微孔板操作，分別在培養(yǎng)2、4、8、12、16、24、36、48、60、72、 120、168 h取樣，以不接種的TSB作為對照組。經(jīng)結(jié)晶 紫染液染色、乙醇洗脫，570 nm波長處測定其OD值，所 得OD值按照培養(yǎng)時(shí)間繪制菌膜形成曲線。每個菌株每個 時(shí)間點(diǎn)均重復(fù)6 次。

1.3.4 酸應(yīng)激對菌株生物菌膜形成的影響

根據(jù)1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)結(jié)果選取代表菌株，研究酸 應(yīng)激對其生物菌膜形成的影響。用3 mol/L乳酸溶液和 1 mol/L鹽酸溶液分別配制系列pH值梯度（pH 3.5、 4.0、4.5、5.0）TSB作為酸性培養(yǎng)液，同時(shí)以未經(jīng)酸處 理的正常TSB作為對照。采用機(jī)械脫落平板計(jì)數(shù)法檢 測菌膜形成。 按1.3.1節(jié)方法進(jìn)行菌液制備，取100?μL備用菌液接 種于10 mL載有不銹鋼片的上述不同酸度TSB中，菌液 濃度約為106 CFU/mL。將接種好的樣品于25 ℃靜置培養(yǎng) 2、4、8、12、24、48、72、120、168 h，規(guī)定時(shí)間取樣 后，對培養(yǎng)裝置里的浮游菌數(shù)和不銹鋼表面形成的生物 菌膜進(jìn)行計(jì)數(shù)。生物菌膜計(jì)數(shù)前用無菌生理鹽水清洗不 銹鋼片3 次以去除鋼片表面未黏附的游離菌體，用拍擊沖擊法采集鋼片表面的黏附菌體，將清洗后的載有生物 菌膜的不銹鋼片放入裝有80 mL無菌生理鹽水的均質(zhì)袋 中，并放入少量無菌棉，在480 擊/min條件下拍擊60 s， 吸取均質(zhì)液進(jìn)行梯度稀釋，涂布至TSAYE平板中，37 ℃ 下培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5 酸應(yīng)激下不同黏附力菌株生物菌膜的CLSM觀察

根據(jù)1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)結(jié)果選取黏附力不同的代表 菌株，采用CLSM比較不同pH值時(shí)代表菌株生物菌膜 的結(jié)構(gòu)變化。按1.3.1節(jié)方法制備菌液，取100?μL備用 菌液接種于10 mL載有不銹鋼片的酸性和正常TSB中， 菌液濃度約為106 CFU/mL。將接種好的樣品于25 ℃靜 置培養(yǎng)，分別在24、72 h和168 h取出，無菌蒸餾水充 分洗滌不銹鋼片以去除其上的游離菌體，吸取LIVE/ DEAD® 熒光染液對不銹鋼片表面進(jìn)行染色，室溫避光 條件下充分作用15 min后，用無菌蒸餾水充分洗滌不銹 鋼片以除去多余熒光染料，室溫避光條件下放置自然干 燥，使用CLSM（60×，油鏡）觀察染色后的生物菌膜 結(jié)構(gòu)。LIVE/DEAD® 為由核酸染料SYTO 9和碘化丙啶 （propidium iodide，PI）復(fù)配的熒光染料；其中SYTO 9 激發(fā)波長和吸收波長分別為480 nm和500 nm，可以將生 物菌膜中具有完整細(xì)胞膜的菌體（活菌）染成綠色，PI 激發(fā)波長和吸收波長分別為490 nm和635 nm，可以將生 物菌膜中細(xì)胞膜損傷的菌體（死菌）染成紅色，從而可 以區(qū)別生物菌膜中的活菌和死菌。每組隨機(jī)選用10 張 CLSM圖像，使用NIS-Element Viewer軟件和Image J 軟件 對圖像進(jìn)行處理。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS 17.0軟件，采用單因素方差分析 及Duncan’s多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

進(jìn)一步選取中等黏附力菌 株ATCC43895為代表菌株，利用機(jī)械脫落平板計(jì)數(shù)法觀 察酸應(yīng)激下不銹鋼表面該菌株生物菌膜的形成。結(jié)果表 明，pH 3.5乳酸-TSB的抑菌效應(yīng)強(qiáng)，該菌株浮游菌數(shù)和 生物菌膜形成數(shù)量均未達(dá)到檢測限，而pH 3.5鹽酸-TSB 對該菌株浮游菌數(shù)和生物菌膜數(shù)量影響均較小，故對 pH 3.5乳酸-TSB和pH 4.0、4.5、5.0鹽酸-TSB未作進(jìn)一步 研究。示。培養(yǎng)24 h時(shí)可 發(fā)現(xiàn)兩種培養(yǎng)條件下均開始有少量單個菌體黏附于不銹 鋼表面，培養(yǎng)72 h時(shí)正常TSB中已有少量小的細(xì)菌“團(tuán) 狀物”出現(xiàn)，而pH 5.0乳酸-TSB組中的菌體出現(xiàn)連接趨 勢，但未觀測到“團(tuán)狀物”出現(xiàn)，培養(yǎng)168 h時(shí)正常TSB 中的菌體連接成“網(wǎng)狀”結(jié)構(gòu)，而pH 5.0乳酸-TSB組中 的菌體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)比較松散，且觀察到較多紅色菌體，表 明死菌數(shù)明顯增加。

3 討 論

食源性致病菌生物菌膜比游離菌體對食品安全的威 脅更大，菌體形成成熟生物菌膜的初始步驟是黏附于接觸面，因此本研究首先對14 株大腸桿菌O157:H7黏附 性能進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)14 株菌株均能在聚苯乙烯微孔表面產(chǎn)生黏附，表明這些大腸桿菌O157:H7都具有形成生物菌 膜的能力，但不同菌株菌膜形成能力存在差異。

4 結(jié) 論

生物菌膜是食品加工中微生物交叉污染的源頭，本 實(shí)驗(yàn)結(jié)合食品加工實(shí)際環(huán)境探究較長時(shí)間酸應(yīng)激對大腸 桿菌O157:H7生物菌膜形成的影響。采用微孔板結(jié)合結(jié)晶 紫染色法比較14 株大腸桿菌O157:H7黏附性能差異，結(jié) 果發(fā)現(xiàn)黏附性能存在明顯菌株差異。選取較強(qiáng)黏附力菌 株J29，中等黏附力菌株ATCC43895和4 株較弱黏附力菌 株，采用微孔板結(jié)合結(jié)晶紫染色法觀察菌膜形成曲線， 結(jié)果表明各菌株均在培養(yǎng)2 h開始產(chǎn)生黏附，但黏附性能 不同的菌株其菌膜形成曲線呈現(xiàn)明顯差異。


 

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