胃癌的發(fā)病率、死亡率在所有惡性腫瘤中位居前列，由于缺乏早期診斷手段，超過 70%的患者確診 時(shí)已有轉(zhuǎn)移或進(jìn)入中晚期。曲妥珠單抗為靶向 HEＲ-2 的單克隆抗體藥物，通過拮抗 HEＲ-2 信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)及抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用發(fā)揮作用，用于 HEＲ-2 過表達(dá)轉(zhuǎn)移性乳腺癌和胃癌的治療。盡 管曲妥珠單抗療效確切，然而腫瘤獲得性耐藥已成為影響其有效治療的重要問題。因此，研究胃癌 曲妥珠單抗耐藥機(jī)制，對(duì)闡明逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)理，增強(qiáng)腫瘤化療敏感性具有重要意義。

Q-Exactive Plus 質(zhì)譜儀和 Easy-nLC 1000 nano 液相色譜儀( 美國(guó) Thermo Fisher 公司) ; VCX500 型 SONICS 多功能超聲儀( 美國(guó) Sonics 公司) ; HS-3 垂直混合儀( 寧波新芝生物公司) ; GL-802B 微型真空 泵( 海門其林貝爾儀器公司) ; 5810Ｒ 型真空濃縮儀( 德國(guó) Eppendorf 公司) ; DYY-6C 型電泳儀( 北京六 一儀器公司) ; CKX31 型光學(xué)顯微鏡( 日本 Olympus 公司) ; LＲH-70 生化培養(yǎng)箱( 上海一恒科學(xué)儀器 公司) 。 NCI N87 和 NCI N87 /Ｒ 細(xì)胞由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院施明教授惠贈(zèng)。注射用曲妥珠單抗( 上海羅氏制藥 有限公司，規(guī)格 440 mg，批號(hào) S20060026) ; 胎牛血清( FBS，美國(guó) Gibco 公司) ; DMEM 培養(yǎng)基和胰酶( 美 國(guó) Mediatech 公司) ; 雙抗( 含 100 μg /mL 鏈霉素和 100 U/mL 青霉素，北京鈕英泰克生物技術(shù)有限公 司) ; pGEX4T2-catTFＲE 重組質(zhì)粒( 上海 Sigma 公司合成) ; Biotin 標(biāo)記的 catTFＲE 引物( 華大基因合成， 引 物 5' 用 biotin 標(biāo) 記， 正 向 引 物: 5'-CCCAGTCACGTAGCGATAGC-3'， 反 向 引 物: 3'-CGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAG-5') ; DNA 聚 合 酶、DNA Ladder、DL2000 DNA ladder ( 日 本 TakaＲa 公司) ; Pure Plasmid Mini Kit、Gel extraction kit、Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒( 北京康為世紀(jì)生 物有限公司) ; NE-PEＲ 核蛋白提取試劑盒、DynabeadsTM M-280 Streptavidin 親和磁珠( 美國(guó) Thermo Fisher 公司) ; 胰酶( 美國(guó) Promega 公司) ; 抗體 c-Jun( 9165) 、JunB ( 3753) 、c-Myc ( 5605) 和 GAPDH ( 5174) ( 美國(guó) Cell Signaling Technology 公司) ; NaHCO3、NaOH( 分析純，美國(guó) Sigma 公司) ; 甲醇、乙醇、 乙腈、甲酸、純水( HPLC 級(jí)，美國(guó) Thermo Fisher 公司) ; NETN、BC-0、2 ×DNA Binding Buffer、1 ×DNA Binding Buffer、BC-150、BC-200、50×TAE 和 Destain 脫色液(自制) 。

親代細(xì)胞 NCI N87 和耐藥細(xì)胞 NCI N87 /Ｒ 采用 DMEM ( 加 10% FBS 和 1%雙抗) 培 養(yǎng)基，在 5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞傳代 2～3 次后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為保持耐藥性質(zhì)，NCI N87 /Ｒ 細(xì)胞 培養(yǎng)過程需加入一定量的曲妥珠單抗，終濃度為 40 μg /mL。

pGEX4T2-catTFＲE 的提取 catTFＲE 序列根據(jù)高等脊椎動(dòng)物轉(zhuǎn)錄因子庫(kù)設(shè)計(jì) ( http: / /jaspar．genereg．net /) ，將其鏈接到 pGEX4T2 載體上，得到全長(zhǎng)為 2．8 kb 的重組質(zhì)粒。將 1 μL pGEX4T2-catTFＲE 質(zhì)粒加入到 50 μL TOP10 感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)熱激、復(fù)蘇后涂布于氨芐抗性 LuriaBertani 平板，37℃ 培養(yǎng)過夜，取單菌落接種于 2 mL Luria-Bertani 培養(yǎng)液，培養(yǎng) 6 h，按 1 ∶ 100 接種至 50 mL 培養(yǎng)基，培養(yǎng) 18 h，按試劑盒說明提取質(zhì)粒。

2．2．3 Biotin 標(biāo)記
 

catTFＲE DNA 擴(kuò)增 引物序列見 2．1 節(jié)，PCＲ 反應(yīng)體系及條件詳見文獻(xiàn)。DNA 序列見電子版文后支持信息。

catTFＲE DNA 的純化與回收 catTFＲE DNA 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶， 使用 DNA 凝膠試劑盒回收、純化，測(cè)定濃度后分裝，!20℃保存，備用。

收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，用預(yù)冷 PBS 清洗 2 次，重懸，800 r/min 離心 5 min，棄 上清液。利用 NE-PEＲ 試劑盒提取核蛋白，加入 CEＲI 和蛋白酶抑制劑，振蕩，冰上裂解 15 min。加入 適量 CEＲII，振蕩 10 s，冰上裂解 30 s，4℃、16000 r/min 離心 5 min，棄去上清液，沉淀加入 NEＲ 重懸，振 蕩 20 s，4℃ 垂直混勻儀孵育 1 h。4℃、16000 r/min 離心 20 min，將核蛋白提取物轉(zhuǎn)移于 EP 管中，用 Bradford 法測(cè)定蛋白濃度。

pull down 取 DynabeadsTM M-280 Streptavidin 適量于 EP 管中，加入 300 μL1 × DNA 結(jié)合緩沖液清洗 M-280，加入計(jì)算量的 catTFＲE DNA( 120 μL M-280 結(jié)合 3 pmol /LcatTFＲE DNA) ， 再加入等量 2×DNA 結(jié)合緩沖液，4℃垂直混勻儀孵育 20 min。用 200 μL BC-200 清洗 M-280，加入核蛋白， 用 BC-0 調(diào)整鹽濃度至 200 mmol /L，4℃孵育 2 h，分別用 50 mmol /L NETN 和 PBS 清洗 M-280。

樣品中加入 20 μL 上樣緩沖液，混勻，95℃ 金屬浴煮 5 min，取上清液，進(jìn) 行 SDS-PAGE 電泳，待 Marker 進(jìn)入分離膠約 2．0 cm 停止電泳，用考馬斯亮藍(lán)染色。將膠條自下而上 橫切成 6 等份，分別置于 EP 管中，加入 500 μL Destain 脫色液，振蕩至完全脫色，加入 200 μL 75%乙 腈，振蕩 30 min，吸去脫色液; 加入質(zhì)譜水 500 μL，振蕩水化 1 h，加入 50 mmol /L NH4HCO3 300 μL，振 蕩 5 min，吸去上清液，加入 100 ng /μL 胰酶-50 mmol /L NH4HCO3( 1∶ 10，V /V) 溶液，搗碎膠條，37℃孵育 過夜，肽段消化后用 200 μL 乙腈萃取 2 次，合并萃取液，12000 r/min 離心 5 min，加入 30 μL 0．1%甲酸， 振蕩 5 min，再加入 200 μL 乙腈，振蕩 5 min，合并上清液，60℃真空抽干，質(zhì)譜檢測(cè)。

參照文獻(xiàn)進(jìn)行重組質(zhì)粒 pGEX4T2-catTFＲE DNA 提取與純化。結(jié)果顯示，在 2．8 kb 位置可見清 晰且無 干 擾 的 目 的 條 帶 ( 圖 1) ，與 DL2000 DNA marker 相比，提取質(zhì)粒濃度≥100 ng /μL，濃度及純 度均符合實(shí)驗(yàn)要求。為檢測(cè)和定量分析曲妥珠單抗耐藥胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn) 錄因子，分別提取 NCI N87 和 NCI N87 /Ｒ 細(xì)胞核蛋 白，利用液相色譜-質(zhì)譜結(jié)合 catTFＲE pull down 的蛋 白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行檢測(cè)和定量分析，采用生物信息學(xué)技術(shù)分析與 DNA 的結(jié)合活性顯著變化 的轉(zhuǎn)錄因子。

從肽段水平設(shè)置 1% FDＲ，共鑒定得到轉(zhuǎn)錄因子 359 個(gè)。為明確數(shù)據(jù)分布，對(duì) NCI N87 /Ｒ 和 NCI N87 樣本的所有蛋白質(zhì)的變化倍數(shù)( Fold change) 進(jìn)行總體分析，以 NCI N87 /Ｒ 與 NCI N87 3 次生物學(xué) 重復(fù)樣本中蛋白質(zhì)峰面積均值之比作為變化倍數(shù)，再進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn) 90%以上的蛋白質(zhì)在 NCI N87 /Ｒ/NCI N87 中的變化倍數(shù)介于 1．5 倍范圍內(nèi)，不足 10%的蛋白質(zhì)豐度變化較大( 這些蛋白質(zhì)具有較 小的 iFOT ( iFOT＜1) ) ，總體數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布( 圖 4A) 。因此，兩組樣本的均值滿足獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)分 析。根據(jù)顯著性水平及均值的變化倍數(shù)繪制餅圖，若某轉(zhuǎn)錄因子在 3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值在兩組樣本中 的比值大于 1．5，即轉(zhuǎn)錄因子與 DNA 結(jié)合活性或其表達(dá)量變化≥1．5 倍( Fold change≥1．5) 且p＜0．05，則 認(rèn)為該轉(zhuǎn)錄因子在耐藥細(xì)胞中被激活，其中 Fold change( NCI N87 /Ｒ/NCI N87) ≥1．5 且p＜0．05表示轉(zhuǎn)錄 因子與 DNA 的結(jié)合活性增強(qiáng)或表達(dá)量增加; Fold change( NCI N87 /Ｒ/NCI N87) ≤0．67 且p＜0．05表示與 DNA 的結(jié)合活性減弱或表達(dá)量降低。

4 結(jié) 論

本研究基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜結(jié)合 catTFＲE pull down 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，檢測(cè)并定量分析了 NCI N87 和 NCI N87 /Ｒ 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，從轉(zhuǎn)錄調(diào)控角度分析了轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動(dòng) NCI N87 細(xì)胞對(duì)曲妥珠單抗 耐藥的可能機(jī)制，并通過生物信息學(xué)手段分析了激活轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的信號(hào)通路，構(gòu)建了其調(diào)控關(guān)系，探 究了轉(zhuǎn)錄因子-靶基因的調(diào)控作用，闡釋了 EMT、Wnt、MAPK、凋亡等通路激活貢獻(xiàn)胃癌細(xì)胞對(duì)曲妥珠單 抗的耐藥性，分析了調(diào)控 EMT、Wnt 和 MAPK 通路的多個(gè)靶基因。本研究為胃癌曲妥珠單抗耐藥機(jī)制 研究提供了依據(jù)，也為逆轉(zhuǎn)其耐藥治療提供了參考。